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細(xì)胞計數(shù)知多少?

發(fā)布時間: 2023-12-12  點(diǎn)擊次數(shù): 359次

今天將為大家介紹的是手工細(xì)胞計數(shù)法。因?yàn)樵诩?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中,細(xì)胞計數(shù)應(yīng)是一項基本功,對于標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)條件以及需要精確定量的實(shí)驗(yàn)來說都非常關(guān)鍵。


下面即是手工細(xì)胞計數(shù)的基本流程、原理和意義:


1.計數(shù)前首先準(zhǔn)備好細(xì)胞計數(shù)器(血球計數(shù)板):


使用70%乙醇將蓋玻片和細(xì)胞計數(shù)板清潔、晾干備用。
將晾干的蓋玻片輕輕覆蓋至血細(xì)胞計數(shù)器上。

(注:使用前須保證蓋玻片和計數(shù)板已充分晾干,否則將影響后續(xù)細(xì)胞充池及計數(shù)結(jié)果。)


2.制備細(xì)胞懸液:


對于貼壁生長的細(xì)胞,我們需要首先使用胰酶消化的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫落。(懸浮細(xì)胞則無需消化,稀釋到合適倍數(shù)即可。)


然后加入適當(dāng)?shù)暮迮囵B(yǎng)基,中和胰酶的作用并重懸細(xì)胞,以得到均質(zhì)的細(xì)胞懸液。要求盡可能將細(xì)胞吹散,不要?dú)埩羧魏渭?xì)胞團(tuán),但不可用力過大。

(注:消化太過或消化不全均會使計數(shù)結(jié)果產(chǎn)生偏差。)

臺盼蘭染色(可選):
如果需要計算細(xì)胞的活率,則需要將細(xì)胞懸液和0.4%臺盼蘭等體積混合;

室溫孵育3-5分鐘(懸浮細(xì)胞染色時間可視情況適當(dāng)延長),使臺盼蘭全部進(jìn)入死細(xì)胞,使死細(xì)胞著藍(lán)色。

3.充池:即血細(xì)胞計數(shù)器加樣

使用吸管或移液器將細(xì)胞懸液或細(xì)胞/臺盼蘭混合液滴加到計數(shù)池的邊緣。此時液滴將在虹吸的作用下進(jìn)入蓋玻片下方的計數(shù)池,此即為充池。

(注:若需進(jìn)行多個樣品的計數(shù),應(yīng)盡量保證每次充池的體積一致,一般在10μl/池左右。)

以同樣的方式在另一側(cè)的計數(shù)池中也加入計數(shù)樣品。

將計數(shù)板靜置幾分鐘使細(xì)胞擴(kuò)散、沉降。


4. 細(xì)胞計數(shù):


在100倍顯微鏡下,移動計數(shù)板將視野對準(zhǔn)計數(shù)板的中央大方塊,該方塊四周有一圈3條平行線包圍,中間有密集的網(wǎng)格。中央方塊區(qū)差不多剛好可以填滿整個視野(圖1中標(biāo)記的3號位置)。

微信圖片_20211011142059.jpg

                     圖1.細(xì)胞計數(shù)板圖解



分別計數(shù)大方格1.2.4.5中的細(xì)胞數(shù)。(為降低計數(shù)誤差,最好將細(xì)胞濃度調(diào)整為20-50個/大方格。)并重復(fù)記錄另一側(cè)計數(shù)池中的細(xì)胞數(shù),總計8個大方塊,然后取均值。


計數(shù)原則為:“數(shù)上不數(shù)下,數(shù)左不數(shù)右"。(判斷標(biāo)準(zhǔn)為是否接觸三條邊線的中間線,如圖2所示)。

微信圖片_20211011142307.jpg

                                      圖2. 細(xì)胞計數(shù)原則



如果有多個細(xì)胞沒有吹散而成團(tuán)存在,此時只可記為一個細(xì)胞。如果團(tuán)塊很多,則需重新吹打甚至重新取樣消化直至絕大多數(shù)細(xì)胞為單個細(xì)胞。

5. 細(xì)胞濃度計算:

微信圖片_20211011142350.jpg

                                             圖3. 樣品充池體積圖解


由圖3可以得出,每個大方格的容積為:

1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 =10-4 cm3= 10-4 ml
即每個大方格的容積為萬分之一毫升,因此在計算每毫升液體中的細(xì)胞數(shù)時需乘以104。

在常規(guī)沒有使用臺盼蘭染色時,可以以下面公式計算每毫升樣品中細(xì)胞的個數(shù):
每毫升樣品中細(xì)胞的個數(shù) = 每個大方格內(nèi)細(xì)胞的平均數(shù) × 細(xì)胞稀釋倍數(shù)×104

如果使用了臺盼蘭染色,還需要計算活細(xì)胞的百分率:
活細(xì)胞百分率(%)= 臺盼蘭拒染細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100

此時活細(xì)胞數(shù)的計算公式為:
每毫升樣品中活細(xì)胞的個數(shù) = 每個大方格中細(xì)胞的平均數(shù)×活細(xì)胞比率×細(xì)胞稀釋倍數(shù)×2×104
注:乘2是由于在臺盼蘭染色時,進(jìn)行了等體積混合,相當(dāng)于稀釋了一倍。


看了以上步驟和原理,大家不禁會問:我們?yōu)槭裁匆獢?shù)細(xì)胞???細(xì)胞計數(shù)究竟有什么意義呢?其實(shí),當(dāng)我們想了解細(xì)胞的生長情況時,除了直接觀察細(xì)胞形態(tài)以外,繪制細(xì)胞生長曲線、計算細(xì)胞倍增時間應(yīng)該就是廣泛采用的評價指標(biāo)了。


所以盡管使用血細(xì)胞計數(shù)板手工計數(shù)細(xì)胞過程十分繁瑣,對實(shí)驗(yàn)者操作者的要求也比較嚴(yán)格,現(xiàn)在也已有很多自動化的細(xì)胞計數(shù)器/儀,但對于科學(xué)研究中遇到的各種細(xì)胞而言,手工計數(shù)仍然是易行的方法而被廣大實(shí)驗(yàn)室采用。



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