細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染是極普遍的問題,面對支原體污染給細(xì)胞培養(yǎng)帶來的巨大難題,世界各國開始重視,并相繼建立了細(xì)胞庫,對細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)展控制,效果很好,支原體污染的問題得以限制。目前已知能污染細(xì)胞的支原體有20多種以上,其中95%以上的支原體污染是口腔支原體。
目前已知的主要污染源是動物血清、胰酶和已污染培養(yǎng)物的氣溶膠,例如,豬鼻支原體通過胰酶,在消化細(xì)胞時進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)物,并造成污染。在原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞的檢測中,原代細(xì)胞與傳代細(xì)胞分離出支原體的頻率是有明顯差異的,傳代次數(shù)越多的細(xì)胞,污染支原體的可能性就越大,這也是多次與動物血清、胰酶和已污染培養(yǎng)物的氣溶膠接觸后造成的,在原代細(xì)胞中,污染率低于4%,而傳代細(xì)胞的污染率則高達(dá)57%~92%。
支原體的介紹
支原體是目前已知一類能在無生命培養(yǎng)基上生長繁殖的最小的原核細(xì)胞微生物,分為兩個屬:一為支原體屬(Mycoplasma),有幾十個種;另一為脲原體屬(Ureaplasma),僅有一種。革蘭染色 為陰性,但不易著色,一般用Giemsa染色,染成淡紫色。
支原體在自然界分布廣泛,無細(xì)胞壁,直徑為0.1-0.3μm,且形態(tài)易變,極易通過除菌過濾器。大部分支原體繁殖速度比細(xì)菌慢,適宜生長溫度為35℃,適合于偏堿條件下生存(pH7.6—8.0),
對酸耐受性差,對75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。對熱比較敏感在細(xì)胞培養(yǎng)過程中如果在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)破碎 的細(xì)胞很多,需要頻繁換液才能維持傳代培養(yǎng)的時候,即應(yīng)懷疑支原體污染。細(xì)胞培養(yǎng)過程中遇到的支原體95%都來自于以下四種支原體:口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無膽甾支 原體, 其中萊氏無膽甾支原體為牛源性。
支原體的污染來源
(1)細(xì)胞之間交叉污染;
(2)細(xì)胞培養(yǎng)操作人員的口腔、皮膚等;
(3)工作環(huán)境或?qū)嶒?yàn)器材的污染;
(4)培養(yǎng)基的污染。
支原體污染示例圖
支原體污染的嚴(yán)重性
(1)細(xì)胞外形可以沒有明顯的變化,支原體可以與細(xì)胞共存,污染后細(xì)胞液不會死亡,培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁;
(2)使用被支原體污染的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)會嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,因?yàn)橹гw會抑制細(xì)胞生長;導(dǎo)致染色 體畸變;細(xì)胞膜抗原性改變;細(xì)胞復(fù)蘇后存活率降低等。
(3)影響細(xì)胞的代謝和功能:培液中的精氨酸被支原體大量消耗,引起細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、rRNA、mRNA的合成障礙;支原體活動使培液成分發(fā)生改變(如發(fā)酵型支原體降解糖類產(chǎn)生酸性物質(zhì)),影響細(xì)胞代謝。
(4)培養(yǎng)過程中細(xì)胞破碎較多,培養(yǎng)基pH變化明顯,需要頻繁更換新鮮培養(yǎng)基;
(5)細(xì)胞被支原體污染后會形成共生體系導(dǎo)致污染不斷擴(kuò)大。
支原體污染的檢測及鑒定方法:
01
分離培養(yǎng)法
支原體的病原學(xué)檢測主要是從被污染的細(xì)胞、雞胚中分離培養(yǎng)出支原體來確定,分離培養(yǎng)法是檢測支原體污染中最為可靠準(zhǔn)確的方法。但是支原體對環(huán)境的影響敏感,容易被滅活,而且分離培養(yǎng)操作相對繁瑣,所需時間較長,因此只能夠?qū)χгw污染進(jìn)行定性觀察。分離培養(yǎng)法在常規(guī)的支原體檢測中多用于輔助其它檢測方法。
02
DNA熒光染色法
DNA熒光染色法較分離培養(yǎng)法縮短了檢測周期,主要用于細(xì)胞培養(yǎng)中污染支原體的檢測。DNA熒光染色法正是利用熒光染色劑雙苯咪唑(Bisbenzimidzole)Hoechst33258能夠結(jié)合支原體DNA中的A-T堿基富集區(qū)域的原理,被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后,其細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一的熒光點(diǎn),即是富含A-T堿基區(qū)域的支原體DNA。
03
PCR技術(shù)
PCR作為一種快速、靈敏、特異且簡便的基因診斷技術(shù)已應(yīng)用于科學(xué)研究和疾病的診斷。根據(jù)支原體基因組內(nèi)的保守序列設(shè)計(jì)特異引物,對待檢樣品的核酸進(jìn)行擴(kuò)增,通過對擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分析作出診斷。PCR檢測技術(shù)用于支原體污染的檢測,周期短、靈敏度高、特異性好、操作簡單且一次可檢測大量樣品。
04
酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)
ELISA用于支原體污染的檢測中,有著良好的特異性和敏感性,一次可以完成大量樣品的檢測。如今已有LONZA等公司開發(fā)了針對細(xì)胞中污染支原體的檢測試劑盒,具有簡便、快速與定量定性檢測等特點(diǎn)。
05
電鏡
一般在細(xì)胞培養(yǎng)48~72小時,細(xì)胞接近匯合前,用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。
06
定期檢測
支原體感染會使培養(yǎng)細(xì)胞慢慢枯萎,因此對培養(yǎng)細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個月就應(yīng)該進(jìn)行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規(guī)化堅(jiān)持下去,是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對支原體感染的關(guān)鍵。
細(xì)胞污染支原體的預(yù)防
細(xì)胞培養(yǎng)工作中,主要從以下幾個方面來預(yù)防支原體的污染:
1)控制環(huán)境污染
2)嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作
3)細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌
4)在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素
支原體污染細(xì)胞后,有必要清除支原體,常用方法有:
1)對于非重要的細(xì)胞,如培養(yǎng)中的細(xì)胞、WCB的細(xì)胞等,將培養(yǎng)物與用過的培養(yǎng)基滅活后丟棄即可。對于較為重要的細(xì)胞,如來源珍貴或?qū)嶒?yàn)室中細(xì)胞保藏量較小等可以采用以下(2)-(8)的方法。
2)用MRA處理:用支原體清除劑(Mycoplasma Removal Agent)處理細(xì)胞,作用濃度為 25μg/ml,兩周可以清除支原體。
3)用清洗純化法清除支原體污染的方法:細(xì)胞營養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌,其原理是利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的。由于支原體個體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至很少. 如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用,可達(dá)到更好的效果。
4)藥物輔助加溫處理:先用藥物處理后,再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時,可殺死支原體,但對細(xì)胞有不良影響。
5)使用支原體特異性血清:用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染,因特異抗體可抑制支原體生長,故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性,并且5個月后仍為陰性。
6)動物體內(nèi)接種除菌法:把受支原體污染的腫瘤細(xì)胞接種在同種動物皮下或腹腔中,借動物免疫系統(tǒng)消滅支原體,而腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)繼續(xù)生長,待一定時間后,從體內(nèi)取出細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。
7)巨噬細(xì)胞吞噬法:從動物腹腔采取巨噬細(xì)胞,為排除其它細(xì)胞成分,可先進(jìn)行純化,然后再加入被支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)液中混合培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中,為檢查支原體是否已被消除干凈,可利用支持物培養(yǎng)法驗(yàn)證,取出支持物逐日染色、鏡檢觀察,至支原體已被消除干凈為止。
8)使用支原體清除培養(yǎng)基,每2~3天更換1次新鮮培養(yǎng)液,換液時用無菌的平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞1~2次;期間如果細(xì)胞密度過大,請保持細(xì)胞密度適當(dāng)(貼壁細(xì)胞可能需要用胰酶消化),并更換新的培養(yǎng)器皿,3天之后,即可見明顯清除效果;處理15天后,可以用支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢測,檢測支原體是否殺滅全部;如果仍有支原體殘留,可以考慮再處理6天;為避免細(xì)胞再次受到“支原體"的污染,以后每隔1個月進(jìn)行支原體的常規(guī)檢測,以保證沒有新的支原體污染。
注:支原體污染時細(xì)胞表現(xiàn)為長得不好,也不死亡,同時,培養(yǎng)基又是清亮的,時間長達(dá)一周也沒有什么變化,這時基本上可以判斷出是支原體污染了。